April 4, 2008

PCR untuk Diagnosa Suatu Penyakit Ikan

Secara umum penyakit ikan dapat disebabkan oleh 2 faktor, yaitu karena infeksi dan non-infeksi. Non-infeksi dapat disebabkan oleh stress, intoksikasi, dan defisiensi. Sedangkan infeksi dapat disebabkan oleh adanya bakteri, jamur, atau virus. Sumber penyakit yang disebabkan oleh faktor non-infeksi relatif mudah diamati melalui perubahan fisiologi dan tingkah laku inang, tetapi penyakit yang disebabkan oleh infeksi (terutama oleh virus) relatif sulit untuk diamati karena umumnya baru menampakkan gejala-gejala klinis setelah tingkat infeksinya tinggi. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi penyakit akibat adanya virus atau bakteri adalah dengan menggunakan metode PCR. Metode ini merupakan salah satu teknik molekular dalam diagnosa penyakit. Tahapan diagnosa meliputi isolasi DNA, amplifikasi PCR, elektroforesis DNA hasil PCR dan visualisasi.

DNA merupakan substansi dasar yang membawa informasi genetik yang akan menentukan fenotipe suatu organisme. Melalui PCR (Polymerase Chain Reaction), DNA akan dapat diperbanyak secara in vitro dengan bantuan enzim polymerase. Sebelum PCR dilakukan, terlebih dahulu harus dilakukan ekstraksi DNA dari genom sel. Sel yang digunakan tersebut diantaranya dapat berasal dari hati, otot, sirip, darah, dan kaki renang.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah

reaksi memperbanyak DNA secara in vitro dengan memanfaatkan cara replikasi DNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu (Lisdiyanti, 1997 dalam Wahyudi, 2001). PCR ini berguna untuk analisis genetik suatu organisme, diagnosa kelainan genetik, serta diagnosa penyakit. Dalam diagnosa penyakit, melalui PCR virus dalam jumlah sedikit pun dapat terlihat sehingga dapat dilakukan suatu langkah pencegahan sebelum virus tersebut menyebar. Keunggulan dari teknik PCR ini dalam diagnosa penyakit antara lain, tingkat akurasi yang tinggi (sensitifitas dan spesifitas), cepat, serta dapat mendeteksi keseluruhan mikroba. Keunggulan lainnya adalah proses isolasi yang relatif cepat dengan jumlah salinan yang dihasilkan dapat mencapai 300.000 salinan dan sangat sensitif dalam mendeteksi sekuen DNA target dari sampel yang diproses (Lewin, 1994 dalam Rohmy, 2001). Selain itu, sekuen DNA yang dibutuhkan sangat kecil sehingga jumlah sampel yang digunakan juga sangat sedikit.

PCR (Polymerase Chain Reaction) secara umum terdiri dari 3 proses, yaitu :

Denaturasi, merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92–95 oC (Newton and Graham, 1997 dalam Rohmy, 2001). Denaturasi awal selama 1–3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Lisdiyanti (1997) dalam Rohmy (2001), menyatakan bahwa denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus dan tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase.

Annealing, merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan hasil amplifikasi.

Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–74 oC bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak (Saiki et al., 1988 dalam Rohmy, 2001).

Extension, merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari siklus ke siklus mengikuti perubahan konsentrasi DNA (Hsu et al., 1996 dalam Wahyudi, 2001).

Jenis PCR antara lain dapat Simple PCR, Reverse-Transcription PCR (RT-PCR), Single PCR, dan Nested PCR. Kesemua jenis PCR tersebut dapat digunakan dalam diagnosa penyakit, hanya saja berbeda dalam hal tingkat sensifitas dan spesifitas. Perbedaan utama antara single PCR dan nested PCR terletak pada banyaknya siklus amplifikasi serta jumlah primer yang digunakan. Pada single PCR terdapat satu siklus amplifikasi yang melibatkan 2 primer. Sedangkan nested PCR memiliki 2 siklus amplifikasi dengan 4 primer. Oleh karenanya nested PCR lebih sensitif dibandingkan dengan single PCR, sehingga mampu untuk mendeteksi virus/bakteri dalam jumlah kecil.

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan salah satu metode penentuan keberadaan DNA. Metode elektroforesis ini dilakukan untuk memisahkan molekul asam nukleat sebagai komponen DNA. Asam nukleat tersebut dipisahkan berdasarkan ukurannya di dalam medan listrik, biasanya di atas media solid (Nicholl, 1984). Sedangkan menurut Eknath et al,. (1991), elektroforesis adalah teknik yang sangat berguna untuk mempelajari komposisi genetik individu dan populasi pada tingkat gen.

Arus listrik yang diberikan diantara dua elektroda menyebabkan DNA berpindah dari kutub negatif menuju kutub positif (Boffey, 1986; Nicholl, 1984). Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis. Ada beberapa buffer yang digunakan diantaranya Tris Asetate EDTA (TAE), Tris pHospate EDTA (TBE) dan Tris Borate EDTA (TPE), serta buffer alkalin elektroforesis (Sambrook et al., 1989). Hasil elektroforesis dapat dilihat setelah dipaparkan dengan cahaya ultraviolet (UV)


PUSTAKA

Boffey, S. 1986. Molecular Biology Techniques. P153-196 dalam Wilson, K. dan Goulding, K.H. (eds). A Biologist’s Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 3th ed. Ricahard Clay Ltd. Britain.

Eknath, A.E. , J.M. Macaranas, R.R. Velasco, M.C.A. Ablan, M.J.R. pante, dan Pullin. 1991. Biochemical and Morphometric Aproaches to Caracterize Farmed Tilapia. NAGA. 14 (2): P7-9.

Nicholl, D. S. T. 1984. An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge University Press. P 21-29.

Rohmy, S. 2001. Keberhasilan Penggunaan Primer Spesifik DNA Mitokondria (mtDNA) Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus) pada Beberapa Ikan Budidaya dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). [Skripsi]. Program Studi Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor

Sambrook, J., E. F. Frtsch, 7 T. Maniatis. 1989. Molecular Clonning : A laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Book 1&2.

Wahyudi, H. T. 2001. Pengaruh Suhu Annealing dan Jumlah Siklus yang Berbeda pada Program PCR Terhadap Keberhasilan Isolasi dan Amplifikasi mtDNA Ikan Patin (Pangasius hypophthalmus). [Skripsi]. Program Studi Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor

:$ Lihat Postingan yang lain yuk :$



1 comments:

diah adwi said...

wii makasih banyak yah infonya :D
jangan lupa kunjungi blog aku juga yaaahh hehehe tq :D

Post a Comment